L'église d'Agios Nikolaos est située en haut, à l'ouest de l'îlot. Elle était composée de deux espaces voûtés oblongs (nefs), dont celui du sud étant plus long et plus haut que celui du nord, qui semble avoir été un ajout postérieur. Il s’agit du seul bâtiment de l'îlot qui remonte aux premiers temps de la période Vénitienne, bien avant la construction des fortifications vénitiennes.

Aujourd'hui, seul le côté oriental est conservé. L'abside de la nef sud préserve encore des traces de fresques représentant la Prière, c'est-à-dire le Christ flanqué de la Vierge Marie et de Jean-Baptiste, ainsi que l'Annonciation de la Vierge, datant du XIVème siècle.

Cette église est la première église que disposait la forteresse de Spinalonga et lors de la construction de la forteresse, elle fut utilisée par les Vénitiens pour répondre aux besoins réligieux immédiats de la garnison. Pendant un certain temps, elle a fonctionné pour les deux confessions, tandis que de temps en temps, elle fut utilisée comme poudrière.